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Letter--S1位點OgTPR1基因介導水稻種間雜交不育

2021-08-24 16:05:55深圳市作物分子設計育種研究院

Interspecific Hybrid Sterility in Rice Is Mediated by?OgTPR1?at the?S1?Locus Encoding a Peptidase-like Protein


First author:?Yongyao Xie; Affiliations: ?South China Agricultural University?(華南農業大學):?Goungzhou?China?

Corresponding author:?Yao-Guang Liu?(劉耀光)


Dear Editor,


The Asian cultivated rice (Oryza sativa?L. ssp?japonica?and ssp?indica) is a staplefood crop (主食作物), and current rice breeding for utilization (利用) of hybrid vigor (heterosis; 雜種優勢) mainly uses crosses within and between?japonica?and?indica?varieties (Chen and Liu, 2016). However, another cultivated rice, African rice (Oryza glaberrima?Steud; 非洲栽培稻/光稃稻), has many important traits, such as tolerance to heat, drought, aluminum toxicity (鋁毒), and disease (Brar and Khush, 1997). Hybrids from crosses between subspecies and species, such as between African and Asian rice varieties, have stronger hybrid vigor and greater yield potential than those within subspecies; these hybrids can also incorporate (包含) many important traits from the parents. However, such hybrids often show severe hybrid sterility (HS; 雜種不育), a postzygotic reproductive barrier (合子后的生殖障礙) that restricts gene flow between species and maintains species identity during speciation (Ouyang and Zhang, 2013).Thus, HS hampers (妨礙) the utilization of heterosis in crops (Linares, 2002). Therefore, identification of the causal genes (原因基因) for HS is important for molecular genetic and evolutionary studies and for crop breeding.



粳稻和秈稻是目前主要的糧食農作物,目前雜種優勢的利用主要是粳稻和秈稻之間的雜交。然而,另一種非洲栽培稻具有非常優異的性狀,比如說其對高溫、干旱、鋁毒基因疾病都有很好的抗性。有研究表明,亞種或種之間的雜交,比如非洲稻和亞洲稻之間的雜交,要比亞種內雜交具有更高的雜種優勢。種間的雜交后代可以包含兩個親本的很多重要性狀。然而,這些種間雜交經常會出現嚴重的雜種不育現象,這種合子后的生殖障礙會限制物種間的基因交流,維持物種形成后物種的特異性。因此,鑒定雜種不育相關基因對于作物育種和分子遺傳及進化研究具有非常重要的作用。



Genetic studies in rice have identified several loci for HS, but only a few the causal genes have been cloned (Ouyang and Zhang, 2013). A “two gene/three component interaction” model is proposed for the?Sa?locus, in which protein-protein interactions among the diverged alleles of two adjacent genes cause allele-specific pollen abortion in?indica japonica?hybrids (Long et al., 2008), while another “Killer-Protector” model is suggested for the?S5?locus, in which three closely located genes interact to cause hybrid female sterility in?indica-japonica?hybrids (Yang et al., 2012).



目前水稻的遺傳學研究已經鑒定了少數幾個跟雜種不育相關的位點,但很少有候選基因被克隆出來。Long?et al.?2008年提出了Sa位點上“基因/三組分互作”模型,認為兩個相聯基因不同等位基因蛋白間的相互作用導致了粳稻-秈稻雜交種的等位基因特異性花粉敗育。另外,Yang?et al.2012年提出了S5位點上“Killer-Protector”模型,認為三個位置上非??拷幕蛞姷幕プ鲗е铝?/span>粳稻-秈稻雜交種的雜交雌性不育。



The?S1?locus?is the most important genetic factor affecting the incompatibility between Asian and African rice, as?S1?heterozygotes show both male and female?sterilities, which eliminate transmission of majority of the?S1?allele of Asian rice in the hybrid progenies (Koide et al., 2008). The?S1?locus was mapped to chromosome 6 (Garavito et al., 2010), but the gene for?S1-mediated HS has not yet been identified.



有研究發現,S1位點是影響粳稻和秈稻間不親和的最重要的遺傳因子,該位點雜合會表現出雄性雌性均不育,這樣會很大程度上限制了亞洲水稻對雜交子代S1等位基因的遺傳。Garavito?et al.已于2010年將S1位點定位到6號染色體上,但具體的基因還未被鑒定。



To clone?S1, we developed a near-isogenic (近等基因) line (NIL-g,?S1-g/S1-g) using an African rice line (IRGC102203) as the?S1-g?allele donor (供體) and a?japonica?rice line (IRAT216), carrying the?S1-s?allele as the recurrent parent (回交親本) (RP-s,?S1-s/S1-s) (Supplemental Figure 1). The RP-s (S1-s/S1-s) and NIL-g (S1-g/S1-g) lines exhibited full fertility, but their hybrid plants (BC9F1,?S1-g/S1-s) showed semi-sterility (半不育) of pollen and spikelets (小穗) due to selective abortion (選擇性敗育) of most male and female gametes carrying?S1-s?(Supplemental Figure 2). Using the BC9F2?population (1335 plants) and molecular markers (Supplemental Table 1), we primarily mapped?S1?to a 90-kb region on chromosome 6 (Supplemental Table 2 and Supplemental Figure 3A). Further fine mapping with 11,000 BC9F3?individuals delimited theS1?locus to?a 29-kb region, based on the?japonica?(cv. Nipponbare) genomic sequence (Figure 1A and Supplemental Figure 3B), which overlapped mostly with the previously mapped?S1?region of 27.8 kb (Garavito et al., 2010).



為了克隆S1位點,作者利用一個非洲稻系IRGC102203作為S1-g等位基因的供體,利用帶有S1-s等位基因的一個粳稻系IRAT216作為回交親本 (RP-s) 來構建一個近等基因系NIL-g。RP-sNIL-g均是完全可育的,但由于他們雜交子代對帶有S1-s等位基因的大部分雌雄配選擇性敗育,最終導致花粉和小穗呈半不育狀態。作者利用含有1,335個個體的BC9F2群體和分子標記手段,成功將S1位點定位到6號染色體上一段90kb的區域。進一步基于基本覆蓋之前定位的S1位點27.8kb的粳稻基因組序列,利用11,000個BC9F3個體的精細圖譜將S1位點定位到29kb的區域。



Based on the annotation of the?japonica?genome, this mapped 29-kb?S1?locus region contains seven predicted open reading frames (ORFs), and here we temporarily named themOsORF1~OsORF7?(Figure 1A). According to our sequencing data and the previously reported genomic sequence (Guyot et al., 2011), this region of the?O. glaberrima?genome lacks?ORF2?andORF5, but possesses (具有) five genomic insertions (IF1~5) that harbor six additional predicted ORFs,?OgORFa1~OgORFa6?(Figure 1A), indicating complex structural variation in this region between the two species. Semi-quantitative and quantitative?RT-PCR?analyses showed that, of the seven common ORFs, only?ORF6?and?ORF7?were expressed in anthers (花藥) and young panicles (圓錐花序) of NIL-g and RP-s at different developmental stages (Supplemental Figure 4).



基于已注釋的粳稻基因組序列,這段29kb的序列區域共包含7個開放閱讀框,作者將其命名為OsORF1OsORF7。根據作者最新的測序數據和之前已報道的基因組序列,非洲栽培稻缺失了ORF2ORF5兩個基因,但其基因組上有額外的五個片段插入包含了另外的6個開放閱讀框OgORFa1OgORFa6I,這個結果表明了這兩個物種在這段區域存在很復雜的結構變異。半定量和定量RT-PCR分析結果顯示在這7個ORFs中,僅有ORF6ORF7NIL-g和RP-s的花藥和早期圓錐花序不同發育階段會有表達。



Previously studies of the?Sa?and?S5?loci indicated that HS is generally caused by genetic interaction between/among diverged alleles of the two parents. Therefore, the common transcription-active?ORF6?and?ORF7?in the two species, which have nucleotide variations, were selected as the candidate genes for the?S1-mediated HS.?Sequencing analysis found a single nucleotide polymorphism (SNP, C-A) in the fifth exon (+731 bp of the coding sequence) of the Asian rice?OsORF6?compared to?OgORF6, resulting in?a premature stop codon?in?OsORF6(Figure 1A). OgORF6?encodes a 774-aa (amino acid) protein containing two trypsin-like peptidase domains and a ribosome biogenesis regulatory domain (RRS). However,?OsORF6?inO. sativa?encodes a truncated protein of 243 aa, containing only one trypsin-like peptidase domain (Figure 1A and Supplemental Figures 5, 6). To distinguish these two proteins, we designated that from?OgORF6?as?OgTPR1?which harbors Trypsin-like Peptidase and RRS domains and that from?OsORF6?as?OsTP1?which contains only Trypsin-like Peptidase domain (Figure 1A).?OsORF7?and?OgORF7?encode F-box-like proteins with 19 aa differences between them (Supplemental Figures 7, 8).



之前關于SaS5位點的研究顯示,雜種不育通常是由親本上兩個或多個不同等位基因的互作所導致的。所以,共轉錄激活具有序列變異的ORF6ORF7被作為S1介導的雜種不育的候選基因進行研究。序列分析發現,在相對于非洲稻OgORF6亞洲稻OsORF6上五分之一外顯子,即731bp處存在一個C轉變為A的SNP,直接導致了OsORF6的提前終止。非洲稻的?OgORF6編碼了774個氨基酸,主要包括了兩個類胰蛋白酶結構域和一個核糖體生物合成調控域,即RRS。然而,亞洲稻中的OsORF6僅編碼了243個氨基酸,僅包含一個胰蛋白酶結構域。為了更好地區分這兩個基因,作者將非洲稻中的OgORF6命名為OgTPR1,而亞洲稻中的命名為OsTP1。另外,OsORF7OgORF7編碼了一個類F-box蛋白,兩者間僅相差19個氨基酸。



To test the basic function of these candidate genes and their role in HS, we used theCRISPR/Cas9?genome editing system (Ma et al., 2015a) to knock out?OgTPR1?(OgORF6) andOgORF7?of NIL-g, with a selected unique target site in the coding region of the genes, respectively, which has no any homologous, potential off-targeting sites in the rice genome (Figure 1A and Supplemental Figures 5, 7). Sequence analysis of the?Cas9-transgenic T0?plants identified four and two plants that had homozygous or biallelic mutations in?OgTPR1?andOgORF7, respectively (Figure 1B and Supplemental Figure 9). These targeted mutations caused frame-shifts (thus loss-of-function), but all these plants exhibited normal pollen and spikelet fertilities (Supplemental Figure 10), indicating that these genes are not essential for the development of male and female gametophytes in rice.



作者進一步利用CRISPR/Cas9基因編輯,設計了特異的靶位點,在保證沒有潛在脫靶效應的情況下,對NIL-g系中的OgTPR1即,OgORF6)OgORF7分別進行基因敲除。序列分析鑒定出Cas9轉基因T0代植株中分別有4株和2株具有OgTPR1OgORF7基因的純合或雙等位基因突變體。這些靶位點突變均造成了移碼突變,導致靶基因喪失功能,然而所有的植物均表現了正常的花粉和小穗育性,揭示這兩個基因對于水稻中雌雄配子的發育是不起關鍵作用的。



To test whether?OgTPR1?and/or?OgORF7?function in?S1-mediated HS, we crossed the fourogtpr1?mutants (ogtpr1-1~ogtpr1-4) and the two?ogorf7?mutants (ogorf7-1?and?ogorf7-2) with the parent RP-s to produce mutant type F1?hybrids (mF1). All the mF1?plants with?ogorf7-1?or?ogorf7-2?showed the semi-sterile phenotype of pollen and spikelets, and the distorted genotypic segregation, similar to the F1?plants of the NIL-g × RP-s cross (Figures 1C-1E, Supplemental Figure 11 and Supplemental Table 3). However, all the mF1?plants with the four mutant?ogtpr1alleles exhibited normal fertilities of pollen and spikelets (Figures 1C and 1D and Supplemental Figure?11), and the segregation of the?S1?genotypes fitted the 1:2:1 ratio (Figure 1E and Supplemental Table 3). These results indicated that?OgTPR1?has a positive role on the?S1-mediated interspecific HS;?loss-of-mutation?of this gene can?rescue?male and female?fertility?in hybrids.



為了測試OgTPR1和(或)OgORF7是否在S1介導的雜種不育中起作用,作者用四個ogtpr1突變體和兩個ogorf7突變體分別和RP-s進行雜交,拿到F1代突變體雜種,即mF1。結果顯示,所有的有ogorf7突變的mF1均表現為跟NIL-g與RP-s雜交F1代相似的表型,即花粉和小穗半不育;而所有的有ogtpr1等位基因突變的mF1均表現了正常育性的花粉和小穗,并且S1基因型分離比符合1:2:1。這些結果表明,OgTPR1基因作用于由S1位點介導的種間雜交不育,該基因突變丟失功能會恢復雜種的雌雄配子育性。



There are more than 16 genes encoding the trypsin-like peptidase domain-containing proteins in the genome of?japonica?rice, but only five of them show over 35% amino acid sequence identity in the trypsin-like peptidase domain with that in OgTPR1 (Supplemental Figure 12). To trace theorigin of the C-A variation?that causes the genetic divergence between?OgTPR1?and?OsTP1, we investigated the sequences of this gene in public databases. In?O. glaberrima?(101 accessions) and its wild progenitor species?O. bathi?(57 accessions),?ORF6?has the C nucleotide at this position, but in all?japonica?and?indica?cultivars (100 accessions for each) and the majority (109 of 114 accessions) of progenitors of the?O. sativa?(O. rufipogon?and?O. nivara),?ORF6?harbors the A nucleotide at this position (Supplemental Table 4). Furthermore, the wild species?O. longistaminata?(2 accessions) and?O. officinalis?(10 accessions) also have the C nucleotide at this gene position, but most of?O. meridionalis?(14 of 18 accessions) have the A nucleotide. These data suggest that this nucleotide variation of the gene occurred early in the ancestral?Oryzaspecies and the diverged alleles have co-existed in the primitive gene pool of the?Oryza?genus.The?A allele?(the truncated form) of this gene might have been?inherited?from?O. rufipogon?into?O. sativa.



在粳稻基因組中有超過16個基因編碼含類胰蛋白酶結構域的基因,但僅有5個與OgTPR1中的類胰蛋白酶結構域具大于35%的氨基酸序列一致性。為了探索引起OgTPR1OsTP1兩個基因遺傳分化的C-A單核苷酸變異起源,作者檢索了所有的公共數據庫,發現在101個非洲稻和其57個祖先品種中,在這個位置的核苷酸都是A,而在所有的100個粳稻栽培種和大部分的栽培稻祖先種中,在這個位置的核苷酸都是C。另外,2個水稻野生種O. longistaminata和10個水稻野生種O. officinalis這個位置的核苷酸都是C,而大多數野生種O. meridionalis在這個位置的核苷酸都是A。這些結果表明,這個核苷酸的變異在稻屬祖先種中就已經存在,并且不同的等位基因在原始稻屬基因庫中共存。水稻中的A等位基因可能是繼承自O. rufipogon。



The “Two gene/three component” and “Killer-protector” models have been proposed to explain the selective abortion of gametes with a certain allele of a parent driven by the opposite allele (e.g., gamete-killer) of another parent in hybrids with heterozygous HS loci (Long et al., 2008; Yang et al., 2012). This study shows that, although the functional defect of?OgTPR1?and?OgORF7do not affect male and female gamete development,?OgTPR1, but not?OgORF7, of the?S1-gallele is indeed necessary for the?S1-mediated HS (Figures 1C-1E, Supplemental Figures 10, 11 and Supplemental Table 3). In the interspecific hybrids, OgTPR1 may function as an?S1-s-specific gamete-killer during male and female gametogenesis in the?African-Asian rice hybrids. The sterility process probably involves either in activation of certain precursor molecules?via?the peptidase domains, or in the ribosome assembly through the RRS domain, as the proposed basic functions of peptidases and RRS proteins (Antalis et al, 2010; Morita et al., 2002). However, as previously shown at the?Sa?and?S5?complex loci that HS can involve in multiple genetic factors, it is possible that other component(s) may also is required for the?S1-mediated HS. Therefore, it is necessary to investigate whether the putative gene(s) specifically present in the?S1-g?allele region (Figure 1A) function in this HS system. This study provides the basis for further study of the underlying molecular mechanism of the?S1-mediated HS and its effect on the speciation of the?Oryza?species.



之前提出的“Two gene/three component”和“Killer-protector”模型均是通過雜種中雜種不育位點雜合子其中某一親本特定等位基因對應的另一親本等位基因所驅動的選擇性敗育來解釋雜種不育的現象。這篇文章的研究指出,OgTPR1OgORF7兩個基因的功能缺失并未影響雌雄配子的發育,但S1-g?等位基因OgTPR1確實是S1位點介導的雜種不育所需的關鍵基因。在種間雜種中,OgTPR1可能作為亞洲稻和非洲稻雜種雌雄配子發生過程中含S1-s配子的特異“殺手”。育性過程可能會牽涉到由肽酶結構域或者通過RRS結構域的核糖體組裝介導的某些前提分子的激活。然而,正如SaS5兩個復雜位點一樣,雜種不育可能會涉及多種復雜的遺傳因子,因此,S1位點介導的雜種不育可能還會有其它作者未發現的組分參與。所以,很有必要繼續研究是否還有其它基因特異存在于S1-g等位基因區域,作用于雜種不育。這篇文章主要是為研究更深層次的S1位點介導雜種不育分子機理和其在稻屬物種分化中的影響提供一個基礎。



Hybrid-compatible (neutral) alleles found at some loci do not produce HS in hybrids, thus are important germplasm (種質資源) resources for hybrid breeding (Long et al., 2008; Yang et al., 2012). However, breeding of hybrid-compatible lines by successive backcrossing is time-consuming, or not feasible if no such neutral allele(s) are detected. In fact, at present breeders lack a natural neutral allele of?S1. In this study, we provide a novel approach to rapidly breed hybrid-compatible lines with an artificial neutral?S1?allele (S1-n) using the CRISPR/Cas9 system to knock out?OgTPR1?of?O. glaberrima?cultivars (Figures 1B-1E, Supplemental Figures 9, 11 and Supplemental Table 3). Such?S1-n?alleles can be used to breakdown the interspecific reproductive barrier, enabling effective utilization of interspecific hybrid vigor and important traits across the two species in rice breeding programs.



某些位點上的雜交親和(中性)等位基因在雜種中不會形成雜種不育,這是雜交育種中比較重要的種質資源。然而,通過連續回交來獲取雜交親和系是非常費時的,甚至有時根本會檢測不到這些中性位點。事實上,現在育種家們正缺少一個S1位點的自然中性等位基因。在這片文章中,作者通過利用CRISPR/Cas9系統敲除非洲稻栽培種中的OgTPR1基因來獲取一個人工的中性S1位點(S1-n)。這種S1-n等位基因可以被用來打破種間生殖障礙,能夠幫助育種家們在水稻育種試驗中更加有效利用種間雜交優勢和某些重要性狀。



doi:?http://dx.doi.org/10.1016/j.molp.2017.05.005


Journal:?Molecular Plant

Published date: May 19, 2017.


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